Zinnober und Zinnober sind an der Ommochrom-Pigment-Biosynthese in den Augen beteiligt, nicht jedoch in den Flügeln von Bicyclus-anynana-Schmetterlingen

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9368 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wenn das gleiche Pigment in verschiedenen Geweben eines Körpers vorkommt, kann man davon ausgehen, dass in jedem Gewebe die gleichen Stoffwechselwege auf ähnliche Weise ablaufen. Hier zeigen wir, dass dies bei Ommochromen, den roten und orangefarbenen Pigmenten, die in den Augen und Flügeln von Schmetterlingen vorkommen, nicht der Fall ist. Wir haben die Expression und Funktion von Zinnoberrot und Zinnober, zwei bekannten Fliegengenen im Ommochrom-Signalweg, bei der Entwicklung von Pigmenten in den Augen und in den Flügeln von Bicyclus anynana-Schmetterlingen getestet, wobei beide Merkmale rötliche/orangefarbene Pigmente aufweisen. Mithilfe der fluoreszierenden In-situ-Hybridisierung (HCR3.0) lokalisierten wir die Expression von Zinnober und Zinnober im Zytoplasma von Pigmentzellen in den Ommatidien, beobachteten jedoch keine eindeutige Expression für eines der beiden Gene auf Larven- und Puppenflügeln. Anschließend haben wir mithilfe von CRISPR-Cas9 die Funktion beider Gene gestört, was zu einem Pigmentverlust in den Augen, nicht aber in den Flügeln führte. Mittels Dünnschichtchromatographie und UV-Vis-Spektroskopie identifizierten wir das Vorhandensein von Ommochrom und Ommochrom-Vorläufern in den orangefarbenen Flügelschuppen und in der Hämolymphe von Puppen. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Flügel entweder lokal Ommochrome mit noch nicht identifizierten Enzymen synthetisieren oder diese Pigmente einbauen, die anderswo in der Hämolymphe synthetisiert werden. Verschiedene Stoffwechselwege oder Transportmechanismen führen daher zum Vorhandensein von Ommochromen in den Flügeln und Augen von B. anynana-Schmetterlingen.

Ommochrome sind rot-orangefarbene Pigmente, die in einer Vielzahl von Arten vorkommen und unterschiedliche Funktionen erfüllen. Sie kommen in pigmenthaltigen Zellen von Krebstieren, Spinnen und Insekten vor und spielen eine wichtige Rolle bei der Farbmusterung, der visuellen Filterung, dem UV-Schutz und der Tryptophan-Entgiftung1. Ommochrome, die in den Pigmentzellen von Insekten-Ommatidien, der optischen Einheit der Insektenaugen, vorkommen, spielen eine wichtige Rolle beim Schutz von Photorezeptorzellen und bei der Gesamtpigmentierung der Augen1,2,3. Ommochrome, die in den roten und orangefarbenen Farbflecken in den Flügeln von Schmetterlingen gefunden werden, wie z. B. den Schmetterlingen Elymnias hypermnestra tinctoria4, Junonia coenia5,6 und Agraulis vanille7, dienen wahrscheinlich als Signalgeber für Partneranziehung oder Raubtiervermeidung.

Ommochrome werden über den Ommochrom-Biosyntheseweg produziert, dessen Enzyme größtenteils an Insektenmodellsystemen wie Drosophila melanogaster8, Tribolium castaneum9, Aedes aegypti10 und den Lepidopteren Bombyx mori11 und Plutella xylostella12 untersucht wurden. Auf diesem Weg wird die Aminosäure Tryptophan in die Pigmente Xanthommatin und Dihydroxanthommatin umgewandelt, die je nach reduzierender Umgebung der Zelle gelb bis rot sein können13. In Drosophila gibt es vier Schlüsselgene, die für verschiedene Enzyme auf diesem Weg kodieren: Vermilion, Kynureninformamidase (kfase), Cinnabar und Cardinal12. Nachdem Tryptophan durch den mutmaßlichen Monocarboxylattransporter Karmoisin14 in Pigmentzellen eingebaut wurde, kodiert Zinnober für die Tryptophanoxygenase, die Tryptophan in Formylkynurenin umwandelt15. Kynurenin-Formamidase (Kfase) kodiert für ein gleichnamiges Enzym, das Formylkynurenin in Kynurenin umwandelt16. Zinnober kodiert für Kynurenin-3-hydroxylase, die Kynurenin in 3-Hydroxykynurenin umwandelt12. Schließlich kodiert Cardinal für die Phenoxazinon-Synthetase, die die Umwandlung von 3-Hydroxykynurenin in Xanthommatin (orange) katalysiert, das unter reduktiven chemischen Bedingungen weiter in Dihydro-Xanthommatin (rot) umgewandelt werden kann13.

Einige der gleichen Ommochrom-Enzym-kodierenden Gene, Ommochrom-Metabolitenvorläufer und ein Regulator des Ommochrom-Transkriptionsfaktors im Auge wurden auch in den Flügeln einiger Nymphaliden-Schmetterlingsarten identifiziert. Bei Vanessa cardui ist Tryptophan in den rot und beige gefärbten Bereichen des Flügels eingebaut17, und in den rot pigmentierten Bereichen der sich entwickelnden Heliconius erato-Flügel kommt es zum Ausdruck von Zinnoberrot und Zinnober18. Spätere Studien haben Optix als einen der wichtigsten Transkriptionsfaktoren identifiziert, der das Vorhandensein von Ommochrom-Pigmenten bei Schmetterlingen reguliert19, da sein Ausschalten zum Verlust der roten und orangen Farbpigmentierung bei mehreren Schmetterlingsarten sowie zur Herunterregulierung von Ommochrom führte Pathway-assoziierte Gene in Flügeln20. Die direkte Rolle von Zinnoberrot und Zinnober bei der Produktion von Ommochrompigmenten in den Flügeln von Schmetterlingen wurde jedoch nicht getestet.

Der Zusammenhang zwischen Optix und bekannten Ommochrom-Pathway-Genen ist auch bei Bicyclus anynana-Schmetterlingen unklar, die aufgrund ihres sequenzierten Genoms und umfangreicher genetischer Werkzeuge zur Expression und Funktionsanalyse ein gutes System zur Untersuchung eines solchen Pathways darstellen. Optix ist eindeutig an der Pigmentierung der künftigen orangefarbenen Schuppenzellen in den Augenfleckmustern der Flügel dieser Art beteiligt, da sein Ausschalten zum Verlust der orangen Farbe führt21. Es ist jedoch unklar, ob die bekannten Ommochrom-Signalweg-Gene für die Produktion von Orangenpigmenten in den Flügeln von B. anynana erforderlich sind. Zu einigen Zeitpunkten wurde Zinnoberrot im mRNA-Massenextrakt der Puppenflügel von B. anynana identifiziert22, Zinnoberrot-Knockouts mit CRISPR-Cas9 haben jedoch keine sichtbare Wirkung auf die Flügel gezeigt23. Darüber hinaus führte das Ausschalten der Ommochromtransporter Weiß und Scharlach auch zu keinem sichtbaren Phänotyp auf den Flügeln, obwohl die Ommatidienpigmentierung beeinträchtigt wurde23. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass (1) Ommochrom-Signalweg-Gene nur in einer kleinen Anzahl von Zellen auf dem Flügel von B. anynana (dem orangefarbenen Ring in den Augenflecken) exprimiert werden, die bisher nicht mit dem CRISPR-Tool erfasst wurden; (2) dass Ommochrome nicht die orangefarbenen Pigmente in B. anynana sind; oder (3) dass Ommochrome nicht in den Flügeln von B. anynana produziert werden, sondern stattdessen von anderen Ommochrom-produzierenden Zellen dorthin transportiert werden.

Um die Beteiligung bekannter Ommochrom-Pigment-Gene an den Flügeln von B. anynana zu untersuchen, untersuchten wir die Expression und Funktion von Zinnober und Zinnober mittels fluoreszierender In-situ-Hybridisierung bzw. CRISPR-Cas9. Als Kontrolle untersuchten wir auch die Expression und Funktion beider Gene in den sich entwickelnden Augen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese beiden Ommochrom-Enzyme für die Augenpigmentierung essentiell sind, aber keine große Rolle bei der lokalen Flügelpigmentsynthese bei B. anynana spielen. Als nächstes identifizierten wir mithilfe von Dünnschichtchromatographie und UV-sichtbarer Spektrometrie das Vorhandensein von Ommochrom-Pigmenten und Ommochrom-Vorläufern im orangefarbenen Ring der Augenflecken bzw. in der Hämolymphe von B. anynana. Wir kommen zu dem Schluss, dass Ommochrom-Pigmente entweder aus einer anderen Quelle in den Flügel eingebaut werden oder dass neuartige Enzyme für die Ommochrom-Synthese im Flügelgewebe dieses Schmetterlings verwendet werden.

Um die räumliche Lokalisierung und die Ausdrucksmuster von Zinnoberrot und Zinnober zu identifizieren, haben wir zunächst das Ausdrucksmuster in den sich entwickelnden Augen von Schmetterlingen mit HCR3.024 getestet. Wir beobachteten für beide Gene klare und unterschiedliche Expressionsdomänen im Zytoplasma der ommatidialen Pigmentzellen (Abb. 1A – F, S1D, E).

Expression und Funktion von Zinnober und Zinnober in den Augen von Bicyclus anynana bei 77 % Puppenentwicklung (PD) (120 h). Ausdruck von (A) DAPI und (B) Zinnoberrot in den Augen. (C) Zusammengeführter Ausdruck von DAPI und Vermilion. Expression von (D) DAPI und (E) Zinnober in den Augen. (F) Zusammengeführter Ausdruck von DAPI und Zinnober. DAPI wird in vier Kernen der Ommatidien exprimiert, und im Zytoplasma dieser Zellen ist Zinnober- und Zinnober-mRNA vorhanden. Erwachsene (G) WT-Augen, (H) zinnoberrote, knusprige Augen und (I) zinnoberfarbene, knusprige Augen. Zinnober-Crisants zeigten homogenere mutierte Phänotypen, während Cinnabar-Crisants Zellflecken mit fehlender Pigmentierung aufwiesen (schwarzer Pfeil). (J) Indels wurden in der Nähe der Stelle gefunden, auf die die Leit-RNA für Zinnoberrot (rotes Kästchen) und für (K) Zinnober zielte.

Anschließend testeten wir die Expression von Zinnoberrot und Zinnober in den Larven- und Puppenflügeln von B. anynana mithilfe von HCR24. Es wurde bereits gezeigt, dass Zinnober und Zinnober eine höhere Expression bei 40 bis 55 % Puppenentwicklung bei Vanessa cardui und Heliconius erato aufweisen17,18, daher haben wir die Expression dieser Gene bis zu diesem Stadium bei B. anynana untersucht. Wir erwarteten eine zumindest teilweise überlappende Expressionsdomäne mit der von Optix, die im orangefarbenen Ring der Augenflecken im Puppenstadium exprimiert wird (Abb. 2K–M, 3K–M, S1, S2)21,25. Keines der Gene zeigte jedoch eine spezifische Expressionsdomäne in den Flügeln (Abb. 2, 3). Bei 77 % (120 h) und 92 % PD (144 h) beobachteten wir jedoch eine leicht homogene höhere Intensität der Fluoreszenz über die Flügel hinweg, was wahrscheinlich auf die Autofluoreszenz von Chitin während der späteren Entwicklungsstadien der Puppenflügelentwicklung zurückzuführen ist, wie Kontrollfärbungen zeigten der gleiche Anstieg der Fluoreszenz (Abb. 2G–J,N,O, 3G–J,N,O).

Ausprägung von Zinnoberrot in den Larven- und Puppenflügeln von Bicyclus anynana. Expression von Zinnoberrot in den (A und B) Larvenflügeln, (C und D) 31 % Puppenentwicklung (PD) (48 h), (E und F) 61,5 % PD (96 h), (G und H) 77 % PD (120 h) und (I und J) 92 % PD (144 h). In den Flügeln wurden keine spezifischen Domänen der zinnoberroten mRNA beobachtet. (K–M) Koexpression von Vermilion und Optix (Positivkontrolle) bei 77 % PD (120 h). Expression des zinnoberroten Sense-Strangs im (N) Vorderflügel und (O) Hinterflügel bei 77 % PD (120 h).

Expression von Zinnober in den Larven- und Puppenflügeln von B. anynana. Expression von Zinnober in den (A und B) Larvenflügeln, (C und D) 31 % Puppenentwicklung (PD) (48 h), (E und F) 61,5 % PD (96 h), (G und H) 77 % PD (120 h) und (I und J) 92 % PD (144 h). In den Flügeln wurden keine spezifischen Domänen der Zinnober-mRNA beobachtet. (K–M) Koexpression von Vermilion und Optix (Positivkontrolle) bei 77 % PD (120 h). Expression des Cinnabar-Sense-Strangs im (N) Vorderflügel und (O) Hinterflügel bei 77 % PD (120 h).

Um zu überprüfen, ob die Ommochrom-Gene in den Puppenflügeln mit 15 % PD (24 h) transkribiert werden, führten wir eine PCR an cDNA des gesamten Flügels unter Verwendung von Primern durch, die für Zinnober, Zinnober und Kynurenin-Formamidase spezifisch sind. Die Daten zeigen, dass mRNAs für diese Gene in geringen Mengen in Puppenflügeln vorhanden sind (im Vergleich zum Referenz-ef1α) (Abb. S3), was mit RNA-seq-Daten aus einer früheren Studie (Tabelle S5) übereinstimmt.

Um die Funktion von Zinnober und Zinnober in den Augen und Flügeln von B. anynana zu validieren, haben wir die kodierende Sequenz beider Gene mithilfe von CRISPR unterbrochen. Während WT-Augen schwarz erscheinen (Abb. 1G), hatten zinnoberrote Crisant-Augen homogene gelbe oder rosafarbene Augen (n = 5) (Abb. 1H) und zinnoberfarbene Crisant-Augen (n = 6) zeigten eine hellere Pigmentierung in Mosaikflecken in den Augen (Abb. 1I). Bei den meisten dieser Personen mit Augenphänotypen (n = 5 Zinnoberrot, n = 4 Zinnober) (Abb. S4, S15) wurden Indels an der CRISPR-Zielstelle durch Illumina-Sequenzierung von aus dem Augengewebe extrahierter DNA bestätigt (Abb. 1J, K). , S5–S9, S16–S19).

Crispants aus Zinnoberrot (Abb. 4B–D, S4) und Zinnober (Abb. 5B–D, S15) erzeugten keine Flügelphänotypen. Um zu bestätigen, ob Zinnoberrot und Zinnober im Flügel erfolgreich ausgeschaltet wurden, führten wir eine Illuminata-Sequenzierung an den Flügeln jedes Individuums durch, das Phänotypen der Augenpigmentierung zeigte. Wir haben bei jedem getesteten Individuum (n = 5 Zinnoberrot, n = 6 Zinnober) Indels an den CRISPR-Zielstellen erhalten (Abb. 4E, S10–S14), (Abb. 5E, S20–S25).

Keine Funktion von Zinnoberrot in den Flügeln von Bicyclus anynana festgestellt. Erwachsene (A und B) WT-Flügel und (B–D) zinnoberrote, knusprige Flügel. Indels an der Stelle von (E) zinnoberroten Crisants aus den jeweiligen Flügeln von (B–D). In den erwachsenen Flügeln wurden keine spezifischen Phänotypen oder Mosaikklone beobachtet. Genetische Störungen am Zielort wurden durch Illumina-Sequenzierung bestätigt. Das rote Kästchen markiert die CRISPR-Zielstelle.

Keine Funktion von Zinnober in den Flügeln von B. anynana festgestellt. Erwachsene (A) WT-Flügel und (B–D) Zinnober-Knusperflügel. Indels an der Stelle von (E) Zinnober-Crisants aus den jeweiligen Flügeln aus der Tafel BD. In den erwachsenen Flügeln wurden keine spezifischen Phänotypen oder Mosaikklone beobachtet. Genetische Störungen am Zielort wurden durch Illumina-Sequenzierung bestätigt. Das rote Kästchen markiert die CRISPR-Zielstelle.

Wir haben ein weiteres bekanntes Ommochrom-Biosynthese-Gen, Kynureninformamidase (kfase), mithilfe von HCR (Abb. S26) und CRISPR (Abb. S27) getestet. In diesem Fall führten Knockouts der kfase zu keinen beobachtbaren Augen- oder Flügelphänotypen (n = 5) (Abb. S27), obwohl die Transkripte während der Puppenentwicklung eindeutig in den Ommatidienzellen lokalisiert waren (Abb. S27; Tabelle S5). ). Für Insektenarten wurde keine bekannte kfase-Mutante gemeldet1.

Da wir bei Zinnoberrot und Zinnober keine Defekte in der Flügelpigmentierung feststellen konnten, wollten wir unbedingt testen, ob im orangefarbenen Schuppenbereich der Flügel erwachsener B. anynana tatsächlich Ommochrompigmente vorhanden waren. Wir haben Pigmente aus den orangefarbenen Schuppen von B. anynana sowie Pigmente aus der orangefarbenen Region zweier Junonia-Arten extrahiert, da Studien an J. coenia zuvor Ommochrome in ihren Flügeln bestätigt haben5. Wir führten ein Dünnschichtchromatographie-Experiment (TLC) mit zwei Kontrollpigmenten mit bekannten Retentionsfaktoren (Rf), Amaranth und Bromphenolblau, durch, um das Vorhandensein von Ommochromen (ebenfalls mit bekannten Rfs) zu identifizieren17 (Abb. 6). Wir beobachteten das Vorhandensein eines Pigments mit dem gleichen chromatographischen Rf-Wert von Dihydroxanthommatin in B. anynana (schwarzer Pfeil, Abb. 6A; Tabelle 1). In J. almana war ein Pigment mit den Retentionseigenschaften von Ommatin-D in höheren Konzentrationen vorhanden (orangefarbener Pfeil, Abb. 6C; Tabelle 1), während J. orythia auf das wahrscheinliche Vorhandensein von Ommatin-D und Xanthommatin hinwies (orange und violett). Pfeile, Abb. 6E; Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen das Vorhandensein von Ommochromen in den Flügeln von B. anynana, obwohl bekannte Ommochrom-Biosyntheseenzyme im Flügelgewebe dieser Art nicht funktionieren. Die Pigmente in den TLC-Banden müssen jedoch durch Massenspektrometrieexperimente weiter validiert werden.

Dünnschichtchromatographie (TLC) der aus den orangefarbenen Abschnitten von B. anynana, J. almana und J. orythia extrahierten Pigmente. (A,B) Pigmente, die aus dem orangefarbenen Ring von B. anynana extrahiert wurden und eine Bande beim Retentionsfaktor (Rf)-Wert von Dihydroxanthommatin zeigen (schwarzer Pfeil). (C,D) Pigmente, die aus dem orangefarbenen Ring von J. almana extrahiert wurden und eine Bande beim Rf-Wert von Ommatin-D zeigen (orangefarbener Pfeil). (E,F) Pigmente, die aus dem orangefarbenen Ring von J. orythia extrahiert wurden und eine Bande beim Rf-Wert von Xanthommatin und Ommatin-D zeigen (violetter und orangefarbener Pfeil). Die Kontrollpigmente Amaranth und Bromphenolblau wandern als rote bzw. blaue Pigmente (roter und blauer Pfeil). Bromphenolblau hat zwei zusätzliche braune und gelbe Bänder und Amaranth hat ein zusätzliches rotes Band. (G) UV-sichtbare Spektren von 77 % (120 h) PD-Puppen-Hämolymphpigmentextrakt, die drei durch farbige gestrichelte Linien markierte Peaks bei Wellenlängen zeigen, die wahrscheinlich Kynurenin (rot, 366 nm), Xanthommatin (blau, 440 nm) und Dihydro entsprechen -Xanthommatin (grün, 470 nm).

Um weiter zu untersuchen, wie Ommochrome in Flügeln von B. anynana vorhanden sind, haben wir die Hypothese getestet, dass Ommochrome und ihre Vorläufer während der Puppenentwicklung aus der Hämolymphe aufgenommen und in die Flügelschuppen eingebaut werden könnten. Wir haben die Pigmente aus der Hämolymphe von Individuen bei 77 % (120 h) PD gereinigt und ihre Absorptionsspektren erhalten (Abb. 6G). Wir beobachteten Absorptionsspitzen bei verschiedenen Wellenlängen von 366 nm, 440 nm und 470 nm. Basierend auf zuvor gemeldeten Werten27,28,29 deuten diese Wellenlängen auf das wahrscheinliche Vorhandensein von Kynurenin, Xanthommatin bzw. Dihydroxanthommatin in der Hämolymphe hin. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einer der Mechanismen, durch die Ommochrome in den Flügeln von B. anynana auftreten, der Transport aus der Hämolymphe sein könnte.

In B. anynana werden die Ommochrom-Enzyme Zinnoberrot und Zinnober während der Puppenentwicklung in den Pigmentzellen der Ommatidien exprimiert, wo sie an der Pigmentsynthese beteiligt sind. Beide Gene werden bei etwa 77 % PD (120 Stunden) in den Augen transkribiert (Abb. 1A–F), wobei Transkripte bereits bei 31 % PD (48 Stunden) und 46 % PD (72 Stunden) nachgewiesen werden (Abb. S1D, E). ). In jedem Ommatidium war die Expression auf die Peripherie beschränkt, wo sich primäre und sekundäre Pigmentzellen befinden1 (Abb. 1A–F). Die meisten zinnoberroten Crisants hatten eine homogene blassorange Augenfarbe (Abb. 1H), während zinnoberfarbene Crisants meist hellrote Flecken in den Augen aufwiesen (Abb. 1I). Diese Ergebnisse ähneln Expressionsstudien an anderen Insektenarten wie Acheta Domesticus und Henosepilachna vigintioctopunctata30,31 sowie Knockout-Studien an Zinnober oder Zinnober bei Tribolium castaneum, Aedes aegypti, Plutella xylostella, Nasonia vitripennis und Helicoverpa zea, die alle adulte Ommatidien veränderten Färbung9,10,12,15,32.

Weder Zinnoberrot noch Zinnober spielen eine funktionelle Rolle bei der Ommochrom-Synthese der Flügel von B. anynana, obwohl in den Flügeln der Puppe mRNAs vorhanden sind, die für beide Enzyme kodieren, und auf den erwachsenen Flügeln wahrscheinlich Ommochrome vorhanden sind. In unseren Experimenten war vor 92 % PD (144 h) keine merkliche Expression dieser Gene in Larven- und Puppenflügeln und Augenflecken erkennbar (Abb. 2, 3). Die funktionelle Validierung dieser beiden Ommochrom-Enzyme mithilfe von CRISPR-Cas9 führte ebenfalls zu keinem beobachtbaren Phänotyp in den Flügeln von B. anynana (Abb. 4, 5, S4, S15), obwohl ein großer Prozentsatz von Messwerten mit Indels vorhanden war, die darauf hindeuten erfolgreiche Knockouts in den meisten Flügelzellen (Abb. 4, 5, S10–S14, S20–S25). Sowohl das Fehlen einer starken Expression von Zinnoberrot und Zinnober auf dem gesamten Flügel als auch das Fehlen von CRISPR-Phänotypen, trotz der Bestätigung genetischer Störungen dieser Gene in jedem Flügel erfolgreicher Augen-Crispants, legen nahe, dass diese Gene bei der Ommochrom-Synthese keine Rolle spielen Flügel von B. anynana. Ob diese Gene bei der lokalen Ommochrom-Synthese in den Flügeln anderer Arten wie Heliconius erato, Vanessa cardui und Junonia coenia17,18,20 eine Rolle spielen oder nicht, muss noch direkt mit beiden Genen getestet werden.

Das Vorhandensein funktionell redundanter Ommochrom-Synthesegene muss in B. anynana weiter untersucht werden. Eine solche funktionelle Redundanz könnte das Fehlen von Phänotypen in Flügeln erklären, wo die Rolle von Zinnoberrot und Zinnober möglicherweise von anderen Genen übernommen wird. Das Fehlen einer klaren Expression von kfase in WT-Flügeln und von mutierten Phänotypen für kfase-Crisants lässt vermuten, dass dieses Gen möglicherweise auch nicht an der Ommochromsynthese auf den Flügeln von B. anynana beteiligt ist. In diesen Crispsants konnten wir jedoch das Vorhandensein von Indels nicht bestätigen. Darüber hinaus muss die Funktion anderer Stoffwechselenzyme wie Cardinal bei B. anynana noch untersucht werden.

Hier haben wir gezeigt, dass Ommochrompigmente wahrscheinlich Teil des orangefarbenen Rings in den Flügeln von B. anynana sind. Es wurde vermutet, dass Ommochrome an der Färbung des orangefarbenen Rings der Augenflecken dieser Art beteiligt sind, basierend ausschließlich auf der Expression und den Funktionsdaten von Optix21, einem vorgeschalteten Regulator von Ommochromen in anderen Schmetterlingen20. Mithilfe der Dünnschichtchromatographie haben wir jedoch im orangefarbenen Bereich der Augenflecken eine kleine Menge eines Pigments identifiziert, das (im Rf-Wert) dem Ommochrom-Dihydroxanthommatin entspricht. Die Identität dieser Ommochrome unterscheidet sich wahrscheinlich auch von den Ommochrompigmenten in den Flügeln von Junonia. Diese Ommochrome scheinen jedoch nicht in Flügelschuppen in sichtbaren Pigmentkörnchen abgelagert zu sein, wie mittels SEM33 (Abb. S28) beobachtet, wie für die Ommatidienpigmentzellen in Insektenaugen beschrieben34. Die genaue molekulare Identität der mittels TLC beobachteten Pigmente bedarf jedoch einer weiteren Bestätigung mittels Massenspektrometrie.

Bei B. anynana können die auf den Flügeln vorkommenden Ommochrome und/oder Ommochrom-Vorläufer in einem anderen Organ synthetisiert, über die Hämolymphe transportiert und über Ommochrom-Transporter in die orangefarbenen Schuppen aufgenommen werden (Abb. 7). Ein ähnlicher Transportmechanismus wurde für die Vorstufe 3-Hydroxykynurin in den Flügeln von Heliconius-Schmetterlingen angenommen18. Frühe Studien haben gezeigt, dass Metaboliten der Ommochrom-Biosynthese von einem Gewebe in die Hämolymphe sezerniert und von einem anderen Gewebetyp verarbeitet werden können. In Ephestia kühniella-Larven war die Aktivität der Kynurenin-3-Hydroxylase (Zinnober) ausschließlich in den Malpighian-Tubuli lokalisiert, während ihr Enzymprodukt 3-Hydroxykynurenin in der Hämolymphe der Larve zusammen mit früheren Metaboliten im Pigmentweg, wie Tryptophan und Kynurenin, nachgewiesen wurde35 (Abb . 7). Puppenommatidien dieser Art sind in der Lage, aus der Hämolymphe stammendes 3-Hydroxykynurenin aufzunehmen und Ommochrome zu produzieren, wenn der Metabolit in die Hämolymphe injiziert wird36. Bei Schmetterlingspuppen von Araschnia levana wurde ein Anstieg von 3-Hydroxykynurenin in der Hämolymphe festgestellt, da rote Pigmente in den Flügelschuppen auftraten, und die Injektion von radioaktiv markiertem 3-Hydroxykynurenin ergab, dass dessen Einbau in den Flügel mit der räumlichen Lokalisierung roter Schuppen zusammenfiel37. Bei Papilio xuthus zirkuliert Kynurenin während der Puppenentwicklung frei in der Hämolymphe und nimmt mit Beginn der Ommatidien-Ommochrom-Bildung an Konzentration zu und nimmt stark ab, wenn eine rote Flügelfarbe erscheint38. Diese Studien legen nahe, dass Ommochrome, die in den Flügeln (und Augen) dieser unterschiedlichen Motten- und Schmetterlingsarten gefunden werden, von der Hämolymphe stammen könnten.

Mechanismus der Ommochrom-Biosynthese und/oder -Aufnahme in den Ommatidia-Pigmentzellen und Orangenschuppenzellen von Bicyclus anynana-Schmetterlingen. In den Ommatidia-Pigmentzellen wird Tryptophan durch den vorgeschlagenen Karmoisin-Transporter aufgenommen, wo es in Gegenwart der Enzyme Vermilion, Kfase und Cinnabar in 3-Hydroxykynurenin (3-OHK) umgewandelt wird. 3-OHK wird im Pigmentgranulat von den Transportproteinen White und Scarlet aufgenommen und dort in Xanthommatin und Dihydroxanthommatin umgewandelt. In den orangefarbenen Schuppen wird Tryptophan entweder durch einen unbekannten Mechanismus in 3-OHK umgewandelt oder über unbekannte Transporter von der Hämolymphe zu den Schuppenzellen transportiert, wo es in Xanthommatin und Dihydro-Xanthommatin umgewandelt wird. Wir schlagen auch das Fehlen von Pigmentkörnchen für Ommochrome in Schuppenzellen vor. Beachten Sie, dass es keine direkten Beweise für die Beteiligung von Karmoisin an der Tryptophanaufnahme bei Drosophila gibt.

Ein alternativer Mechanismus zur Erklärung des Vorhandenseins von Ommochromen in Flügeln, denen die Ausprägung von Zinnoberrot und Zinnober fehlt, könnte die Verwendung unterschiedlicher Enzyme in Flügeln und Augen beinhalten (Abb. 7). Bei Vanessa Cardui identifizierten differenzielle Genexpressionsanalysen, die über verschiedenfarbige Regionen des Flügels durchgeführt wurden, 26 Gene, die möglicherweise an der Ommochrom-Pigmentierung beteiligt sind. Zu diesen Genen gehören Optix, Kfase, Cinnabar, sieben Transporter der Major Facilitator Superfamily (MFS), zwei Juvenilhormon-bindende Proteine ​​und zwei nicht klassifizierte Transporter39. Bemerkenswert ist, dass die Ommochrom-Transportergene Weiß und Scharlach zwischen den getesteten Zeitpunkten und den unterschiedlich gefärbten Bereichen der Flügel von V. cardui nicht unterschiedlich exprimiert wurden. Bei Heliconius wurde auch die Expression von drei neuartigen Transportergenen im Zusammenhang mit Rotflügelmustern gefunden40. Bei B. anynana führten CRISPR-Knockouts der Ommochrom-Transporter White und Scarlet ebenfalls zu keinem sichtbaren Phänotyp auf den Flügeln23, was auf die Möglichkeit hindeutet, dass in den Schuppenzellen all dieser Arten neue Enzyme sowie Ommochrom-Transporter vorhanden sind. Daher ist es möglich, dass im Laufe der Evolution in den Flügeln von B. anynana andere Enzyme und Transportproteine ​​eingesetzt wurden als in den Augen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die Ommochrom-Biosyntheseenzyme Zinnoberrot und Zinnober an der lokalen Produktion von Pigmenten in den Augen, nicht aber in den Flügeln von Bicyclus-anynana-Schmetterlingen beteiligt sind. Diese Enzyme könnten immer noch an der Produktion der Ommochrom-Pigmente beteiligt sein, die sich schließlich in den orangefarbenen Bereichen der Flügel ablagern, aber sie scheinen in den Flügelzellen selbst nicht funktionsfähig zu sein. Ommochrompigmente bzw. Pigmentvorläufer werden entweder nach den beiden untersuchten enzymatischen Schritten in die Schuppenzellen transportiert oder in situ über neuartige Enzyme synthetisiert.

HCR3.0 wurde basierend auf zuvor beschriebenen Protokollen24 durchgeführt. Kurz gesagt, Flügel- und Facettenaugengewebe wurden zu den gewünschten Zeitpunkten nach der Verpuppung in 1X PBS-Lösung bei Raumtemperatur präpariert und in Glasvertiefungen mit 4 % Formaldehyd in 1X PBS fixiert. Nach 30 bis 40 Minuten Fixierung bei Raumtemperatur wurden die Gewebe zweimal 3 Minuten lang in 1X PBS und dann zweimal in 1X PBS, ergänzt mit 0,1 % Tween 20 (1X PBST), gewaschen. Die Permeabilisierung erfolgte durch 30-minütige Inkubation der Gewebe in einer Detergenslösung mit 1,0 % SDS, 0,5 % Tween 20, Tris-HCl (pH 7,5), 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und 150,0 mM NaCl. Puppenflügel im Spätstadium (> 60 % Puppenentwicklung) mit dickeren Kutikeln wurden in 2,5 μl Proteinase K in 200 μl 1X PBST für 2 Minuten bei 55 °C verdaut, um die Gewebedurchlässigkeit für den Sondeneintritt zu verbessern. Anschließend wurden die Flügel auf Eis gelegt und die Verdauungsmischung durch 2 mg/ml Glycin in 1X PBST ersetzt, um die Reaktion zu stoppen. Anschließend wurden die Gewebe dreimal mit 1X PBST und zweimal mit 5X SSCT gewaschen. Die Gewebe wurden 30 Minuten lang in 30 % Sondenhybridisierungspuffer bei 37 °C inkubiert, bevor eine längere Inkubation in 30 % Sondenhybridisierungspuffer mit 0,02 μM Primärsonden (spezifisch für Zinnober, Zinnober und Kfase) bei 37 °C für 16 Stunden erfolgte . Die Gewebe wurden viermal in 30 % Sondenwaschpuffer in 15-Minuten-Intervallen bei 37 °C und zweimal mit 5X SSCT bei Raumtemperatur gewaschen. Die Gewebe wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Amplifikationspuffer und anschließend 12 Stunden lang im Amplifikationspuffer mit sekundären Fluoreszenzsonden im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gewebe wurden dann viermal in 20-Minuten-Intervallen in 5X SSCT gewaschen, 5 Minuten lang mit in 5X SSCT verdünntem DAPI inkubiert und zweimal mit 5X SSCT gewaschen. Die Gewebe wurden auf einem Glasobjektträger in Montagepuffer montiert und mit einem konfokalen Olympus FV3000-Mikroskop abgebildet.

Die CRISPR-Cas9-Genbearbeitung für Zinnober-, Zinnober- und Kynureninformamidase wurde gemäß dem zuvor beschriebenen Protokoll41 mit den folgenden geringfügigen Anpassungen durchgeführt. Für alle Gene wurden synthetische Leit-RNAs (crRNA) mit dem benutzerdefinierten IDT-Guide-Design-Tool entworfen (Sequenzen in der Ergänzungsdatei). Eine Lösung aus Duplexpuffer, Cas9-Puffer und äquimolaren Mischungen aus crRNA und Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA wurde 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert und vor der Zugabe von Cas9-Nuklease auf Raumtemperatur abgekühlt.

Wir haben das Vorhandensein von Zinnober- und Zinnobermutationen sowohl im Puppen- als auch im adulten Gewebe bestätigt. Puppenflügelgewebe wurden von Individuen entweder bei 25 bis 28 % (40–44 Stunden) oder 44 bis 47 % (70–74 Stunden) der Puppenentwicklung präpariert. Die DNA wurde mit dem Omega Bio-tek EZNA Tissue DNA Kit (SKU: D3396-01) extrahiert und gereinigt. Bei erwachsenen Knusprigen wurden Augen- und Flügelgewebe isoliert und beide Gewebearten wurden separat unter Verwendung der oben erwähnten DNA-Extraktionstechniken verarbeitet. Die Paired-End-Sequenzierung wurde an Sequenzierungsbibliotheken durchgeführt, die aus der amplifizierten Region von Interesse bestanden, und das Vorhandensein von INDELs wurde mit Geneious v10.1.3 überprüft.

Die Pigmentextraktion aus Flügelabschnitten wurde nach einem zuvor definierten Protokoll durchgeführt5,17. Die orangefarbenen Schuppenbereiche der Flügel wurden mit einer feinen Schere aus dem erwachsenen Flügel von B. anynana, J. almana und J. orythia isoliert (Abb. 6). Präpariertes Flügelgewebe wurde in angesäuertem Methanol (0,5 % HCl) unter Verwendung von 0,01 mm großen Zirkoniumperlen in einem Homogenisator (Next Advance Bullet Blender) homogenisiert. Das Homogenat wurde 5 Minuten lang bei 14.000 U/min zentrifugiert und der Überstand wurde 30 Minuten lang in einer Vakuumzentrifuge (ThermoScientific) getrocknet und in 20 µl Methanol rekonstituiert. Die Pigmentmischungen sowie die Referenzfarbstoffe Amaranth und Bromphenolblau wurden auf eine Kieselgelplatte (F254, Merck) aufgetragen und mit Phenol (SigmaAldrich) als Entwicklungslösungsmittel betrieben. Die Werte des Retentionsfaktors (Rf) wurden als Verhältnis der Migrationsstrecke der Pigmentverbindung zu der auf ImageJ gemessenen Lösungsmittelfront berechnet.

Nach der Aufzucht bis zu einer Puppenentwicklung von 61,5 % wurde Puppenhämolymphe aus Wildtyp-B.-anynana-Individuen extrahiert. Ommochrompigmente wurden mit kaltem Methanol nach einem zuvor definierten Protokoll18 aus der Puppenhämolymphe extrahiert und in absolutem Methanol verdünnt. Hämolymphpigmentproben wurden in 1,5-ml-Küvetten überführt und die Absorptionsspektren wurden mit einem Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer erfasst. Die Spektraldaten wurden mit Shimadzu UVProbe und R Software analysiert.

Erwachsene wurden einen Tag lang bei –20 °C eingefroren. Die Schmetterlingsflügel wurden mit einer feinen Schere entfernt und unter einem Leica DMS1000-Mikroskop abgebildet. Für die Bildgebung erwachsener Augen wurden Erwachsene 40 Minuten lang bei –20 °C eingefroren, um das Ausmaß postmortaler Farbveränderungen der Facettenaugen vor der Bildgebung zu minimieren.

Puppenflügelgewebe wurde von Wildtyp-Individuen mit 15 % PD (24 Stunden) präpariert und in Invitrogen™ RNAlater™ Stabilisierungslösung gelagert. Die Gesamt-RNA wurde mit dem Qiagen RNeasy Plus Micro Kit (Kat.-Nr. 74034) extrahiert und gereinigt. Komplementäre DNA wurde mit Invitrogen™ SuperScript™ II Reverse Transkriptase (Kat.-Nr. 18064014) synthetisiert und auf 50 ng/μL verdünnt. Die PCR wurde mit der cDNA unter Verwendung von Primern durchgeführt, die für die Gene von Interesse und das Referenzgen ef1α (Tabelle S4) spezifisch sind, unter Verwendung von 2× PCRBIO Taq Mix Red (Kat.-Nr.: PB10.11-20) für 32 Zyklen. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1 %igen Agarosegel laufen gelassen und unter einem Geldokumentationssystem (Azure 200 Gel Imaging System: AZI200) abgebildet.

Eine feine Metallnadel wurde verwendet, um Schuppen von erwachsenen WT-Flügeln zu entfernen. Die Skalen wurden dann auf einem Kohlenstoffband montiert, das an einem REM-Stummel befestigt war, mit Platin beschichtet mit dem JEOL JFC-1600 Auto Fine Coater und unter einem JEOL JSM-6701F Feldemissions-REM abgebildet.

Die in der aktuellen Studie analysierten Datensätze sind im NCBI-Repository verfügbar. Alle verwendeten Sequenzen sowie ihre Gen-IDs und der direkte Link sind in der Zusatzdatei aufgeführt.

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Wir danken CBIS, NUS für den Zugang zum konfokalen Mikroskop fv3000, Associate Professor Leong Weng Kee und Teresa Lim für ihre Unterstützung und Zugang zum UV-Visible-Spektrophotometer, Lee Ka Yau (SEM-Einrichtung, Department of Chemistry, NUS) für seine Hilfe bei der Bildgebung der REM-Proben und Suriya Narayanan Murugesan für die Bereitstellung erwachsener Schmetterlinge von Junonia almana und Junonia coenia. Wir möchten auch Professor Robert D. Reed für seine unschätzbaren Einblicke bei der Interpretation unserer Ergebnisse danken.

Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation (NRF) Singapur im Rahmen ihres Investigatorship-Programms (Auszeichnung NRF-NRFI05-2019-0006) und des NRF Competitive Research Program (Auszeichnung NRF-CRP20-2017-0001) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: How Hong Chuen Shaun und Tirtha Das Banerjee.

Abteilung für Biowissenschaften, National University of Singapore, Singapur, 117557, Singapur

Wie Hong Chuen Shaun, Tirtha Das Banerjee & Antónia Monteiro

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Schreiben – Originalentwurf: HHCS, TDB; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: HHCS, TDB, AM; Konzeptualisierung: TDB, AM; Methodik und Untersuchung: HHCS, TDB; Validierung: HHCS, TDB; Formale Analyse: HHCS, TDB; Ressourcen: AM; Datenkuration: HHCS, TDB; Visualisierung: HHCS, TDB; Aufsicht: TDB, AM; Projektleitung: AM; Finanzierungseinwerbung: AM

Korrespondenz mit Tirtha Das Banerjee oder Antόnia Monteiro.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shaun, HHC, Banerjee, TD & Monteiro, A. Zinnoberrot und Zinnober sind an der Ommochrom-Pigmentbiosynthese in den Augen, aber nicht in den Flügeln von Bicyclus anynana-Schmetterlingen beteiligt. Sci Rep 13, 9368 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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Eingegangen: 13. Februar 2023

Angenommen: 05. Juni 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36491-9

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